INTRODUCCIÓN
En la actualidad la isquemia cerebral es uno de los retos más importantes para la investigación básica y aplicada. Aunque han sido muchos los avances producidos en el terreno fisiopatológico, pocas medidas terapéuticas han cristalizado en el campo clínico1. Los mecanismos moleculares involucrados en la isquemia cerebral presentan continuas vías lesivas de potenciación e inhibición que convergen en un fenómeno final común, la lisis celular. Esto conforma un escenario cada día más complejo e interrelacionado. La hipotermia es la medida terapéutica neuroprotectora más eficaz en la actualidad2. Se trabaja con muchas sustancias que pueden bloquear una o varias de estas rutas metabólicas3. Parece que la aplicación de una sola medida difícilmente podría contrarrestar una cascada con tal variedad de componentes, por lo que se buscan combinaciones de fármacos con la hipotermia que logren una mayor preservación neuronal4.
A la vista de los excelentes resultados mostrados en los trabajos en modelos de isquemia focal, en los que se ha empleado mesilato de tirilazad, magnesio e hipotermia moderada (32-33 ºC), utilizaremos esta combinación por primera vez en un modelo de isquemia cerebral global y aplicando las medidas terapéuticas tras desencadenarse el daño isquémico5-7. El objetivo primario se logrará si existiera una mayor preservación de las neuronas viables con el tratamiento neuroprotector. Aunque no se realizará una evaluación neurológica funcional de los animales, valoraremos la recuperación global del animal por la capacidad que tiene de recobrar peso comiendo de forma espontánea.
MÉTODO
Animal experimental
Se utilizaron 28 ratas adultas tipo Wistar, del sexo masculino y con un peso entre 300 y 450 g. En todo momento se han respetado las leyes de manejo y experimentación animal vigentes en nuestro país.
Preparación y controles de monitorización
Los animales eran trasladados al laboratorio de experimentación con varios días de antelación para su aclimatación. En la noche anterior al experimento se permitía el acceso al agua pero sin ingesta de alimento. Previo al inicio del experimento se pesaban las ratas. Para la inducción anestésica se utilizó una dosis intraperitoneal de 50 mg/kg de tiopental sódico, y una dosis de 0,5 mg/kg de atropina subcutánea. Se realizaba la intubación orotraqueal con un catéter de 16 G y se conectaba a un ventilador mecánico (Bomba Harvard®, modelo 683). Si era necesario, durante el procedimiento se utilizaban dosis adicionales de un tercio de la dosis inicial de tiopental en forma de bolo único. Una lámpara incandescente permitía mantener la normotermia. Se alojaba una sonda de temperatura esofágica. Se disecaba la vena femoral izquierda que se canalizaba con un catéter de polietileno P50 (Intramedic), utilizado para infundir la dosis de medicación (magnesio, mesilato de tirilazad) o la infusión de suero salino al 0,9%. Se canalizaba la arteria de la cola con un catéter P50, a través del cual se administraban 100 Ul de heparina sódica. Se utilizaba para la obtención de muestras sanguíneas la monitorización de la presión arterial y la provocación de la isquemia. Se obtuvieron muestras sanguíneas para la determinación de gases arteriales, glucosa, potasio y calcio antes de la inducción de la isquemia global y a las tres horas de la misma. Se utilizó un equipo computarizado Powerlab (Panlab S.L.) de 4 canales, con el software adecuado (Chart v4.0.4 y Scope v.3.6.6) para el registro, almacenamiento y análisis de los datos (frecuencia cardíaca, temperatura central y presión arterial sistémica).
Modelo experimental de isquemia cerebral global
Se utilizaba un modelo de oclusión de dos vasos con hipotensión arterial sistémica para provocar la isquemia cerebral global. Tras monitorizar la rata se disecan ambas arterias carótidas primitivas. Previo a la inducción isquémica se mantenía un período de estabilidad de 15 minutos, y tras extraer una muestra sanguínea se inducía la isquemia mediante el clampaje carotídeo bilateral mediante clips vasculares y la reducción simultánea de la presión arterial media a 45 mmHg mediante exanguinación (colección sanguínea en una jeringuilla heparinizada a través del catéter de la cola). Tras 10 minutos de isquemia se liberaban los clampajes carotídeos y se reinfundía la sangre (en dos períodos, uno rápido hasta alcanzar cifras tensionales normales, reinyectando el resto más lentamente).
Grupos de tratamiento
Iniciada la reperfusión, se realizaba la asignación aleatoria de las ratas a cada uno de los tres grupos siguientes de tratamiento:
- Grupo I: vehículo más normotermia (n = 10).
- Grupo II: vehículo más hipotermia (n = 10).
- Grupo III: mesilato de tirilazad más sulfato de magnesio con hipotermia (n = 8).
La hipotermia (temperatura central: 32-33 ºC) se aplicaba durante dos horas y se conseguía mediante la retirada de la lámpara incandescente y la aplicación cutánea en cabeza y tórax de paquetes de hielo. Durante el enfriamiento-recalentamiento se administraba bromuro de pancuronio (0,3 mg/kg intravenoso) para evitar la tiritona. El sulfato de magnesio y el mesilato de tirilazad (Pharmacia & Upjohn Company, Michigan, USA) se administraban por vía intravenosa durante 15 minutos, con una dosis cuando se iniciaba la reperfusión y una segunda dosis a las 2 horas de la inducción de la isquemia. Las dosis de sulfato de magnesio eran de 1 mmol/kg y las de mesilato de tirilazad de 3 mg/kg.
Período de recuperación
Tras dos horas de hipotermia se procedía a la recuperación de la normotermia (retirada de los paquetes de hielo y aplicación de una fuente exógena de calor) si se había producido. Alcanzada la temperatura central de 35 ºC retirábamos los catéteres y se dejaba a la rata despertar. Cuando recuperaba la ventilación espontánea se suspendía la ventilación mecánica y se retiraba el catéter endotraqueal y simultáneamente la sonda esofágica. Posteriormente se pesaba la rata, para tener un peso basal a partir del cual valorar las modificaciones del peso al séptimo día postisquémico. Para los cuidados postoperatorios se colocaban las ratas en receptáculos con lámpara de calor y se permitía acceso libre al agua y alimentos. Cuando la movilización era plena se retiraba la fuente de calor.
Sacrificio y necropsia
En el séptimo día de evolución se sacrificaban los animales. Tras administrar 100 mg/kg de tiopental sódico intraperitonealmente se pesaba la rata y se conectaba al ventilador mecánico. Se abría la cavidad torácica, se introducía un catéter intravenoso en el ventrículo izquierdo y se realizaba una sección en vena cava inferior para producir un circuito abierto. A través del catéter intraventricular se infundían 200 ml de suero salino heparinizado, y luego una perfusión de 100 ml de formaldehído al 4% (pH 6,9) (Merck®). Mediante una craniectomía amplia se extraía el cerebro en bloque y se sumergía durante 24 horas en formaldehído al 4%.
Método histopatológico
Tras este período se realizaban cortes transversales de 2 mm de grosor, desde el polo frontal al occipital, embebiéndolos en parafina, y mediante un microtomo de precisión se realizaban cortes de 8 µm, que se teñían con la técnica de hematoxilina y eosina. Se localizaban los cortes que contenían los hipocampos derecho e izquierdo, y se realizaban proyecciones en un monitor de 21 pulgadas mediante la fotografía digital de imágenes de 400 aumentos en el área CA1 del hipocampo (Cámara Leica DC100; Leica Microsystems®) utilizando el software correspondiente (software Leica IM50 versión 1.2; Leica Microsystems®). Se cuantificaban las neuronas íntegras, sin alteraciones morfológicas, que se visualizaban, realizando un mínimo de dos conteos en diferentes zonas del área CA1 del hipocampo del mismo corte, y hallando la media. La cuantificación de las neuronas preservadas fue realizada por un único observador que desconocía el grupo al que pertenecían las muestras.
Método estadístico
Los datos cuantitativos se expresan como media ± desviación estándar. Los datos son comparados mediante el análisis de la varianza de una vía. Posteriormente se realizan análisis post hoc, como la prueba de Dunnet y la de Bonferroni. Si las condiciones de aplicación de la varianza no se cumplen se utiliza la prueba de Kruskal-Wallis. En todos los casos se utiliza un nivel p < 0,05 para que una determinada diferencia sea considerada significativa. Para el análisis se utilizó el programa estadístico SPSS versión 11.5 (SPSS Inc®).
RESULTADOS
Se realizó una asignación aleatoria, con 10 ratas válidas en el grupo I (normotermia), 10 ratas en el grupo II (hipotermia) y 8 ratas en el III (hipotermia más fármacos). El peso de las ratas era de 397,7 ± 35,5 g para el grupo I, 379,0 ± 45,9 g para el grupo II y 421,3 ± 19,5 g para el grupo III, sin encontrarse diferencias significativas. El tiempo de ventilación mecánica oscilaba entre 3,0 y 6,3 horas, con unos valores de 4,58 ± 1,28 horas para el grupo I, 5,05 ± 0,45 horas en el grupo II y 4,48 ± 0,37 horas en el grupo III, sin diferencias significativas. Mientras que los tiempos de isquemia y de hipotermia eran fijos en el experimento, la variabilidad en el despertar presentó diferencias particulares, con independencia o no de la aplicación de hipotermia. Sólo se administró dosis extra de tiopental en el 50% de las ratas del grupo I. La cantidad de sangre extraída para lograr una presión arterial media de 45 mmHg tenía una media para los tres grupos de 3,84 ± 1,11 ml, sin diferencias significativas entre ellos (3,73 ± 0,98 ml en el grupo I, 4,08 ± 1,11 ml en el grupo II y 3,57 ± 1,79 ml en el grupo III).
En la tabla 1 se muestran los valores de las variables fisiológicas antes de la isquemia y a las 3 horas (todos los animales tenían una temperatura central≥ 35 ºC). No existieron diferencias significativas en los valores de glucemia previos a la isquemia, a pesar de un valor medio mayor en el grupo I. A las 3 horas el grupo III presentaba unos valores significativamente mayores con respecto a los otros dos grupos y con respecto a sus valores previos a la isquemia. Aunque existen diferencias significativas en la concentración preisquémica de sodio, con mayores diferencias de los grupos II y III respecto al I, se corrigen a las 3 horas de iniciada la isquemia.
Tomando el peso postextubación como referencia, comprobamos que existe una pérdida importante del peso a los 7 días (tabla 2). Así, se produce una media de descenso de 50 g para el grupo I, 47,8 g para el II y 49,2 g para el III. Si se transforman en porcentajes de pérdida con respecto al peso postextubación, los valores medios son el 12,75%, el 12,4% y el 11,9%, respectivamente. No existen diferencias significativas entre estos valores.
Hemos realizado dos recuentos celulares neuronales en cada animal, uno en cada uno de los hipocampos, y luego hemos realizado la media de los anteriores para tener una estimación de lo que ocurre de forma global en el hipocampo (hipocampo global). En el grupo I existen 39,3 ± 10,0 neuronas viables en el hipocampo derecho, 38,0 ± 9,6 en el lado izquierdo y 38,7 ± 8,8 neuronas viables en el hipocampo global. En el grupo II existen 44,7 ± 10,4 neuronas viables en el hipocampo derecho, 44,1 ± 9,4 en el hipocampo izquierdo y 44,4 ± 8,3 cuando se considera el hipocampo de forma global. En el grupo III existen 57,7 ± 5,1 neuronas viables en el hipocampo derecho, 53,1 ± 9,5 en el izquierdo y 55,4 ± 5,1 neuronas viables cuando el hipocampo se considera de forma global. Existen diferencias significativas tanto en el lado derecho, izquierdo o globalmente (fig. 1). Si realizamos un análisis post hoc, existe un alto grado de significación estadística del grupo III respecto al I cuando se comparan el lado derecho, izquierdo o globalmente. Cuando se comparan los grupos II y III se obtienen significaciones estadísticas en el lado derecho y en el hipocampo globalmente, pero no en el lado izquierdo. Cuando se comparaban los grupos I y II no se encontraban diferencias significativas en ninguno de los lados ni globalmente (fig. 2).
Figura 2. Diferencias en el número de neuronas viables entre grupos considerando cada lado del hipocampo.
DISCUSIÓN
Nuestro estudio demuestra que, con las condiciones señaladas, el tratamiento combinado de hipotermia moderada, mesilato de tirilazad y sulfato de magnesio preserva un mayor número de neuronas que en el grupo normotérmico o aplicando hipotermia en solitario. Tomando como base el grupo normotérmico, en el grupo de hipotermia existe un 13,7% más de neuronas en el lado derecho, un 16,1% más en el lado izquierdo y una media de un 14,9% más de neuronas de una forma global. Aunque no se alcanza una significación estadística, se produce una menor pérdida neuronal cuando se aplica la hipotermia como medida única neuroprotectora. De forma similar, en el grupo de fármacos más hipotermia (grupo III), cuando se compara con el grupo I, existe un 46,8% más de neuronas en el lado derecho, un 39,7% más en el lado izquierdo, con una media de un 43,3% más de neuronas de forma global. Estas diferencias son claramente significativas. Cuando comparamos los grupos que han recibido hipotermia, III y II, existe una preservación neuronal de un 29,1% mayor en el lado derecho, un 20,4% en el lado izquierdo y un 24,8% mayor en el hipocampo considerado de una forma global, a favor del primero. Estas diferencias han tenido significación en el hipocampo derecho y considerado globalmente, pero no en el izquierdo.
Así, asistimos a una gran eficacia de la combinación farmacológica con hipotermia en la preservación neuronal, superando a la hipotermia en solitario, la medida neuroprotectora más eficaz que se conoce. Puesto que el magnesio y el tirilazad incrementan la neuroprotección de la hipotermia, algunos autores indican la posibilidad de que el mecanismo neuroprotector inducido por la hipotermia8 no sea antioxidativo (tirilazad)9 ni antiexcitotóxico (magnesio)10.
La hipotermia ha logrado mantener una tendencia a favor de la preservación neuronal con respecto a la normotermia, aunque no se alcanzaron resultados estadísticamente significativos. La duración de la hipotermia debe relacionarse con la gravedad de la lesión11, por lo que tal vez deberíamos haber prolongado los tiempos de isquemia, o puede ser que el aumento de la muestra fuese suficiente.
La excelente seguridad del magnesio y mesilato de tirilazad ha sido confirmada en ensayos clínicos, con unos efectos secundarios bien caracterizados12,13. Los valores fisiológicos y parámetros bioquímicos no suponen una alteración destacable que influya sobre los resultados del experimento. Existen dos efectos, ambos relacionados con la administración de magnesio, que es importante vigilar, la hipotensión arterial sistémica y la hiperglucemia14. El sulfato de magnesio ha demostrado excelente tolerancia hemodinámica en estudios multicéntricos, que se han visto confirmados en este estudio por la ausencia de diferencias significativas en la presión arterial sanguínea15. La utilización de otras sales, como el cloruro de magnesio, se asocia con una mayor tendencia a la hipotensión16. A esta no significativa caída de la tensión arterial cuando se administraba magnesio contribuyó tanto la utilización de la forma sulfato, con menor efecto hipotensor, como la administración lenta del preparado, intentando infundir concentraciones asumibles por el sistema vascular. Otro efecto de mayor interés es la aparición de hiperglucemia17. Dado que el tirilazad no tiene actividad glucocorticoidea, se atribuye al magnesio la causa de la hiperglucemia, conocida su interacción con la insulina18. Este efecto depende mucho de la sal empleada, siendo también más frecuente con el cloruro de magnesio19,20. De hecho, son los estudios con esta sal los que se suelen asociar a una significación estadística. En cambio, cuando se utiliza el sulfato de magnesio el aumento no suele ser significativo, aunque en nuestro trabajo sí lo sea21,22. Dada la importancia conocida del control de la glucemia sobre la lesión cerebral una línea futura sería el tratamiento de estas elevaciones mediante el aporte de insulina23.
No se han podido demostrar diferencias en la pérdida de peso entre grupos. Dado que todos los animales del estudio estuvieron comiendo y bebiendo a partir del primer día, debemos suponer que el catabolismo predomina en un espacio temporal tan cerca del procedimiento isquémico. Por ello, tal vez un tiempo más prolongado de observación fuera necesario para mostrar diferencias en un contexto de estrés tan intenso.
Dada la complejidad de los mecanismos fisiopatológicos implicados en la muerte neuronal isquémica, crece entre los investigadores la noción de la combinación de una o más drogas neuroprotectoras con la hipotermia, para realizar un bloqueo suficientemente eficaz de la cascada metabólica postisquémica5,18,24-31. Este hecho crece en importancia cuando la administración farmacológica se realiza posterior al insulto isquémico, y no con anterioridad, momento en que la respuesta es de mayor intensidad32. La elección de la hipotermia es obvia, al ser la medida neuroprotectora más intensa y hoy en día un estándar en el tratamiento de la isquemia cerebral. La concomitante elección de magnesio y tirilazad ha sido consecuencia de la existencia de unos efectos secundarios mínimos, probadas ambas en ensayos clínicos y su utilización conjunta en una serie de experimentos en el seno de la isquemia focal y global que demostraban su utilidad.
Pero los excelentes resultados de la aplicación de estos fármacos en el tratamiento clínico del enfermo con isquemia cerebral focal no han sido tan rotundos como demostraban los ensayos experimentales con animales33-36. Existe un continuo debate sobre el porqué resultados positivos en el laboratorio no lo son en el contexto clínico37. Se han dado múltiples respuestas, pero parece razonable intentar que el contexto clínico y el de laboratorio se parezcan. En el presente estudio hemos intentado reproducir el contexto de isquemia global que atiende el clínico lo más fielmente posible, aplicando las medidas con posterioridad al insulto isquémico, e intentando simular lo más fielmente posible los cuidados aplicados.
Así, dado que en nuestro trabajo la combinación terapéutica de hipotermia, mesilato de tirilazad y sulfato de magnesio ha demostrado un adecuado grado de preservación neuronal, y dado que sus efectos secundarios sobre el hombre son suficientemente conocidos y estudiados, se deberían plantear aproximaciones de este tipo a la práctica clínica puesto que nos encontramos ante una entidad clínica, la isquemia cerebral global, que presenta unas escasas medidas eficaces y una alta repercusión funcional a nivel de morbimortalidad y de repercusión social (estado vegetativo crónico persistente tras parada cardiorrespiratoria reanimada, etc.).
Declaración de conflicto de intereses
Los autores han declarado no tener ningún conflicto de intereses.
*Este artículo es un resumen de la tesis doctoral presentada en julio del año 2004 en la Universidad de Salamanca, con la calificación de Sobresaliente Cum Laude. No ha sido financiado por ningún laboratorio
ni ninguna otra empresa privada.
Correspondencia: Dr. M. Sánchez-Casado.
C/ Puerto de la Cruz, 2, 2.º B.
45600 Talavera de la Reina. Toledo. España.
Correo electrónico: marcel55@terra.es
Manuscrito aceptado el 14-IX-2006.
